摘要：对分离纯化得到的龙井43多酚氧化酶同工酶在30～50 ℃下的热稳定性进行了分析，发现多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃时的热稳定性最高，随温度的升高其热稳定性下降；多酚氧化酶粗酶的热稳定在40 ℃时最高，并整体高于多酚氧化酶同工酶的热稳定性。试验结果给茶叶生产中维持适当的温度来控制多酚氧化酶的活性提供了依据。
关键词：茶叶；多酚氧化酶；同工酶；酶活力；热稳定性
中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0095-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.024
Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensis
CHEN Sheng-hu， XU Xiao-yun， WU Meng-yao， HUANG Ying-jie， YAO Yan-ni， HUANG You-yi
（Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract：The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30～50 ℃，the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃，and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃， and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.
Key words：Camellia sinensis； polyphenol oxidase； isozyme； enzyme activity； thermal stability
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO， EC 1.10.3.1）在茶叶生理代谢及产品加工中具有重要作用。目前对茶叶PPO粗酶[1-3]研究较多，对其同工酶[4-6]也有一些报道，但整体而言对茶叶PPO同工酶的研究相对匮乏[7，8]。除在绿茶[9]中需要快速钝化PPO外，红茶加工[10，11]以及固定化酶体外制备茶黄素[12-14]等过程中都需要PPO具有很好的催化活性和热稳定性。已证实茶叶PPO单一同工酶较粗酶有更高的催化效率[5，7]，并且茶叶PPO基因克隆和外源表达等方面的研究进展[15，16]也使得催化活性高、热稳定性佳的单一同工酶的工业化利用成为可能。本研究在成功分离纯化得到PPO同工酶的基础上，分析了PPO同工酶的热稳定性，丰富了对茶叶PPO同工酶的研究，可为生产中控制茶叶PPO的活性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
龙井43号（Camellia sinensis var. Longjing 43）一芽二叶鲜叶于2015年春采自华中农业大学茶学专业教学基地。
试验仪器：DEAE Sepharose CL-6B（GE Health Bio-Sciences AB公司）； Sephadex G-150（美国PHARMACIA公司）；HH-2型恒温水浴锅（江苏金坛中大仪器厂）；Synergy HT酶标仪（基因有限公司）。所用试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 PPO同工酶分离纯化 按许雷等[7，17，18]PPO同工酶分离纯化方法进行分离纯化。取适量茶鲜叶，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮，5%，W/V）和0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（料液比1∶2），冰浴研磨，4 ℃下浸提12 h，离心、过滤制得粗酶液。对粗酶液进行30%～80%的硫酸铵沉淀，将所得沉淀用适量0.02 mol/L、pH 7.2磷酸盐缓冲液溶解后，再用4倍体积同样的缓冲液脱盐，制得上样液。将上样液用DEAE-Sepharose CL-6B材料进行阴离子交换层析，选用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液各2倍柱体积进行梯度洗脱，280 nm下检测吸收峰并收集、脱盐、浓缩。再将收集峰用Sephadex G-150材料進行凝胶过滤层析，选用含有0.10 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液等梯度洗脱，280 nm下检测吸收峰并收集、脱盐、浓缩。重复上述过程，收集足量样品，4 ℃保存备用。