摘要:本文建立了一种简便、快速的提纯方法,从猪心肌中分离纯化得到肌球蛋白。实验结果表明,通过超速离心和硫酸铵分级盐析,主要杂蛋白被除去。所得蛋白经SDS-PAGE、HPLC和XRD图谱分析,说明提纯的肌球蛋白达电泳纯,并有结晶特征。测定其比活力为0.293U/mg,活力得率42.1%,纯化倍数4.9。本法具有成本低,纯度高,酶活良好的特点,结果满意。
关键词:心肌肌球蛋白;分离纯化;硫酸铵盐析
中图分类号:Q512.2 文献标识码:A
心肌肌球蛋白(cardiac myosin,CM)分子量约520KDa,由两条重链(MHC,220 KDa)和两对轻链(MLC1,27KDa;MLC2,20KDa)组成[1]。CM具有ATP酶活性,是心肌的主要结构和收缩蛋白。心肌收缩能力受多种因素的影响,兴奋收缩耦联的各个环节都能影响收缩力,其中肌球蛋白ATP酶活性是控制收缩能力的主要因素。
研究表明,CM结构或功能的改变与心室功能障碍、心力衰竭和心律失常等心肌病变有直接关系[2,3]。因此,从心肌组织中有效分离纯化CM,是在分子水平上,深入研究心肌病变的发病机理和预防措施的重要前提。目前提取纯化CM都是利用肌球蛋白在高离子强度下可溶,而在低离子强度下不溶的性质进行的,但大多操作繁琐,成本高,蛋白收率低或ATP酶活损失大[4-11],因此,寻找更佳的CM提纯方法具有重要意义。
本文对提纯方法进行了部分改进,从猪心肌提取了CM,建立了CM的纯化方案。此方案仅需简单的超速离心、硫酸铵分级盐析操作,即可达到纯化要求,且所用材料均为实验室常规用材,费用低廉,可广泛应用于实验室操作及临床研究。
1 实验部分?
1.1 仪器、材料与试剂?
1.1.1 主要仪器
CP100MX超速冷冻离心机(HITACHI, 日本),Centrifuge5417R 台式冷冻离心机(eppendorf, 德国),Ultra Freeze 5410超低温冰箱(HETO公司,捷克),CR22G高速冷冻离心机(HITACHI, 日本),DY-Ⅲ垂直平板电泳成套设备(北京六一仪器厂),GeneGenius & GeneGnome凝胶成像系统(SYNOPTICS LTD, 英国),MAXI-DRY LYO真空浓缩(冻干)系统(HETO公司,捷克),L-7000高效液相色谱仪(L-7455 DAD 检测器,L-7300柱温箱,L-7100四元梯度泵,D-7000 HPLC 系统工作站软件包。HITACHI,日本),C18柱(江苏汉帮科技有限公司),D8-Advance Powder X-射线粉末衍射仪(Bruker公司,德国),HH-4 恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂), FK-A 组织捣碎机(江苏金坛佳美仪器公司), pHS-25酸度计(上海伟业仪器厂),磁力加热搅拌器(江苏省金坛医疗仪器厂)。?
1.1.2 材料与试剂
新鲜猪心(冰生理盐水洗净后-70℃冰箱保存);低分子量Marker蛋白(上海基康生物技术有限公司);牛血清白蛋白(BSA, 分子量68 000, 电泳纯, Sigma公司); Na2ATP(AR Sigma公司);β-巯基乙醇(AR Amresco 公司);SDS(AR Sigma公司);丙烯酰胺(AR 广州维佳科技公司, 日本分装);N", N"-甲叉二甲基双丙烯酰胺(AR 瑞士进口分装);硫酸铵(AR Sigma公司);N,N,N",N"-四甲基乙二胺(TEMED, AR 上海润洁有限公司, 生化试剂);考马斯亮蓝R-250、G-250(AR Amresco 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris, AR Sigma公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为超纯水。?
1.2 实验方法?
1.2.1 CM的提取及纯化
4℃下操作。pH7.4的Tris-HCl缓冲液中均含有0.001 mol•L-1EDTA,0.01 mol•L-1NaPPi,0.002 mol•L-1β-巯基乙醇和0.005 mol•L-1MgCl2。?
1.2.1.1 CM粗提液的制备
取猪心左心室适量,剪成小块后加入400 mL 0.05 mol•L-1磷酸缓冲液(pH=6.8)匀浆,3600 rpm离心10 min,反复4次,弃上清。沉淀溶于适量0.01 mol•L-1 Tris-HCl缓冲液(含0.5 mol•L-1KCl),离心,上清即为CM粗提液。?
1.2.1.2 低盐析出,浓盐溶解
上清中加入9倍体积超纯水,调节溶液pH至5.4,缓慢搅拌3 h后10000 rpm离心10 min。用适量0.05 mol. L-1Tris-HCl(含1.0 mol•L-1 KCl)溶解沉淀,并用0.01 mol. L-1 Tris-HCl(含0.5 mol•L-1 KCl)透析过夜。?
1.2.1.3 超速离心
于透析后的溶液中加入等体积超纯水及Na2ATP,使Na2ATP的浓度为0.002 mol.L-1。静置2 h后30000 rpm离心60 min,收集上清。?
1.2.1.4 硫酸铵分级盐析
在上清液中加入研细的(NH4)2SO4达到36%饱和度,用(NH4)2SO4饱和度为36%的0.05 mol•L-1 Tris溶液调节pH在6.8~7.0之间,静置2 h后12000 rpm 离心。再向上清液加入(NH4)2SO4使饱和度达41%,用(NH4)2SO4饱和度为41%的0.05 mol•L-1 Tris溶液调节pH在6.8~7.0之间,静置2 h后离心。沉淀物用少量0.01 mol•L-1Tris-HCl(含0.6 mol•L-1KCl,不含MgCl2)重溶、透析24 h,更换透析外液4~5次。所得浓缩的CM溶液分装或冷冻干燥后,冷冻储存。?
1.2.2 蛋白质含量测定
采用Bradford法[12],以BSA为基准物质,绘制标准曲线。?
1.2.3 CM的ATP酶活力测定
参照文献[13]的方法,建立酶反应体系,置37℃水浴中孵育反应10 min。离心后取上清25 μL测定A660。根据磷标准曲线确定无机磷含量。规定肌球蛋白ATP酶活性单位(U)为单位时间(1 min)内单位质量(1.0 mg)的肌球蛋白催化ATP分解所释放的无机磷的微摩尔数,即1U=1 μmol•mg-1•min-1,此酶活单位即为单位比活力。?
1.2.4 CM的纯度鉴定
将样品蛋白用0.01 mol•L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.5, 0.6 mol•L-1 KCl, 0.01 mol•L-1 NaPPi, 0.001 mol•L-1 EDTA, 0.002 mol•L-1β-巯基乙醇, 0.005 mol•L-1 MgCl2)稀释到1.0 mg•mL -1,取适量与2倍上样缓冲液等体积混合同Marker蛋白一起加热煮沸5 min。冷却至室温后离心(6000 rpm,5 min),取上清液上样10 μL,Marker蛋白上样20 μL。采用PAGE不连续垂直板不连续电泳法[14],浓缩胶浓度4%,分离胶浓度10%,凝胶厚度约0.75 mm,调节电压80 V开始电泳,当溴酚蓝指示剂迁移至浓缩胶和分离胶界面时将电压升至120 V,稳流电泳2 h。胶片用考马斯亮蓝R-250染色,置摇床经甲醇-冰乙酸-水(25?8?67,V/V)溶液脱色至透明后于凝胶成像系统下观察结果并摄像。?
1.2.5 HPLC条件
流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,样品浓度 1.6 mg•mL-1,进样量 10 μL,检测波长λ = 254 nm,C18柱(250×4.6 mm)。流动相A:6%乙腈,流动相B:0.20 mol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0),流动相A?流动相B(V/V) = 60%?40%。?
1.2.6 X-射线粉末衍射条件
X-射线源Cu Kα 线,电压40 kV,电流40 mA,扫描角度20～120°(2θ),扫描速度1°•min-1。
2 结果与讨论?
2.1 猪心肌CM的分离纯化
表1为猪心肌CM分离纯化过程中蛋白收率和酶活力变化情况。对CM粗提液和硫酸铵盐析纯化后的总蛋白、总活力、比活力进行测定,计算活力得率,纯化倍数,统计结果见表2。
在低盐析出、浓盐溶解过程中,本文对文献方法进行改进,在降低离子强度的同时,调节溶液pH至CM的等电点,使沉淀更加完全。由表1可知,肌球蛋白逐步被纯化,经硫酸铵分级盐析后,CM收率为4.5 mg•g-1湿组织。该结果是亲和层析纯化法的23倍[10],与Shiverick [8] 的结果相近,而文献方法溶液用量大,需多次超速离心,操作繁琐。
表2说明,CM粗提液的比活力为0.064U•mg-1,纯化后的比活力为0.293 U•mg-1,纯化倍数4.9, 活力得率42.1%。文献[15]采用DE 52层析法的纯化倍数为2.9,活力得率7.8%,效果不如本法。
2.2 CM纯度鉴定
CM提纯过程中的SDS-PAGE图谱(图1)说明,超速离心(图1(3))和分级盐析(图1(4)、(5))步骤去除了分子质量约43KDa的肌动蛋白(actin)和其它杂蛋白,但也有部分CM损失。纯化的CM(图1(5))显示了典型的肌球蛋白电泳带,最上面一条为重链,下面两条为两对轻链,与文献报道一致。重链下方的一些细小条带,可能是提纯过程中CM自身降解所致[16,17]。因此,在缓冲液中加入焦磷酸钠、EDTA、ATP、Mg2+等,并尽量缩短时间、低温操作,可起到降低CM聚合、保持其酶活性的作用[18]。
M-Marker蛋白; 1-粗提的肌球蛋白; 2-浓盐溶解所得蛋白;3-超速离心所得蛋白;4-弃去的36%饱和度(NH4)2SO4沉淀;5-终产物即41%饱和度(NH4)2SO4沉淀?
2.3 HPLC分析
图2显示了相同条件下,CM的粗提液和纯化后的HPLC图。
色谱条件:流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,λ = 254 nm,进样量 10 μL(1.6 mg•mL-1),C18柱(250×4.6 mm),流动相A:6%乙腈,流动相B:0.20 mol•L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0),流动相A?流动相B(V/V)= 60%?40%
由图2可知,保留时间2.21 min的组分为纯化的CM,通过超速离心和硫酸铵盐析等步骤,除去了保留时间2.05 min的主要杂蛋白。?
2.4 X-射线衍射(XRD)图谱
图3为CM的XRD图谱。图中显示了确定的锐衍射峰,其中2θ 在28.4°和40.6°出现两个强的衍射峰,在45~80°出现三个较弱的衍射峰,说明CM具有一定结晶性的特征[19]。
3 结论
对传统方法稍加改进,从猪心肌中提取CM,并用36-41%饱和度硫酸铵进行纯化。利用SDS-PAGE、HPLC和XRD对CM的纯化程度进行了表达和分析。提纯后CM的 HPLC图显示单一峰,电泳谱带与文献报道一致,说明硫酸铵盐析有效除去了肌动蛋白和其它杂蛋白,纯化的CM基本达电泳纯。CM的XRD图谱有两个强的衍射峰,说明其有结晶性特征。提纯的蛋白得率为4.5 mg•g-1湿组织,比活力0.293 U•mg-1,纯化倍数4.9,活力得率42.1%。与文献相比,本法操作简单、成本低廉,得率高并保持了较高的酶活性,具有较高的实用价值。
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