川芎药材HPLC指纹图谱研究
摘要：目的 建立川芎药材的高效液相色谱指纹图谱。方法 使用色谱柱Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长323 nm。通过提取11个色谱峰作为指纹图谱共有峰，分别采用相似度评价，聚类分析和主成分分析等方法，对所收集的18批样品进行系统比较与归类。结果 通过比较18批川芎的色谱图，确定了11个共有峰，大部分样品的相似度在0.9以上，并将不同川芎分为3大类。结论 该方法重复性好，简便可靠，可以为川芎的质量控制和评价提供依据。
关键词：川芎；指纹图谱；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0086-04
川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。川芎始载于《神农本草经》，味辛、微苦、性温，具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛之功，用于血瘀气滞所致的月经不调、痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛，风寒湿痹、跌打肿痛等[1-2]。
现代化学和药理研究表明，川芎的活性成分主要包括挥发油类、酚酸类和生物碱类[3-4]，川芎的质量和道地性均与活性成分的含量和种类紧密相关。中药质量评价一直是中药研究与应用中的难点与重点问题，而建立在中药成分系统研究基础上的中药指纹图谱分析是一种综合、有效的评价手段，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法之一[5-8]。为了更深入地研究并揭示川芎的质量差异，本试验对18个批次的川芎药材采用高效液相色谱法（HPLC）并结合“中药材指纹图谱相似系统”和SPSS统计软件进行分析，从而评价川芎药材的质量。 1 仪器与试药
美国Waters e2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器Waters2998和柱温箱CTO-20A；Thermo C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（FA1204B，上海精密科学有限公司）；恒温水浴锅（HH-2K6，巩义市予华仪器有限责任公司）。
阿魏酸对照品（批号110773-200611，纯度≥98%，中国药品生物制品检验所），甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。川芎对照药材（批号120927-200604，中国药品生物制品检验所）。川芎药材共18个批次，经南京中医药大学刘圣金老师鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，密封保存于阴凉干燥处。样品来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：10%A（0 min）～48%A（36 min）～80%A（70 min）；流速：1.0 mL/min；检测波长：323 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液制备
精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸328 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备
精密称取川芎粉末2.0 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇30 mL，于70 ℃水浴中加热，冷凝回流提取1 h，放冷，过滤，残渣同法再提取1次，过滤，合并2次滤液，水浴挥干，用甲醇溶解并定容至10 mL，14 000 r/min离心5 min，吸取上清液，过0.45 ?m滤膜，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，考察阿魏酸色谱峰保留时间和峰面积的一致性，均RSD<3.0%，说明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。
2.4.2 稳定性试验 取S9供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样10 ?L，依法测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%。表明川芎样品在室温条件下24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验 取S9样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%，表明本方法重复性良好，
2.5 指纹图谱测定
取18批川芎药材，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录60 min色谱图。通过比较18批川芎的色谱图，确定了11个共有峰，其中4号峰为阿魏酸。结果见图1。
2.6 指纹图谱的建立与分析
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，4号色谱峰（阿魏酸）分离度较好，峰面积适中，且为各样品共有，故选择4号峰为参照峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将18批川芎样品色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成川芎提取物的色谱指纹图谱共有模式（见图2），并在分析检验模式下，以样品S1图谱作为参照图谱，计算相似度（见表2）。结果显示，2号样品的相似度<0.9，其他产地的川芎药材相似度均≥0.9。
2.6.3 聚类分析 应用SPSS20.0统计分析软件中的系统聚类法中的组间连接法，对川芎HPLC指纹图谱共有峰的峰面积进行分析，选取平方欧氏距离作为样品测度。利用此方法对18批川芎进行综合系统聚类分析，聚类分析图反映的是各样品的相似程度，样品间的分类距离值越大则表明各样品差异性越大。当分类距离取11时，18类川芎样品被分为3类：第Ⅰa类为样品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱa类为样品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1，第Ⅲa类为样品S4。